Assemblies werden entweder durch Gammabestrahlung oder durch Autoklavieren sterilisiert.
Die Bestrahlung mittels Gamma-Strahlen erfolgt durch spezialisierte Dienstleister, die die Assemblies einer hohen Dosis Gammastrahlung aussetzen. Die Strahlung zerstört eventuell vorhandene biologische Moleküle, indem sie deren Struktur aufbricht.
Da Single-Use-Assemblies bereits vor der Bestrahlung mindestens in luftdichten Polymerbeuteln eingeschweißt sind, kann eine Kontamination nach der Sterilisation ausgeschlossen werden.
Die Sterilität wird durch eine gleichbleibende Mindeststrahlendosis garantiert, deren Wirksamkeit in vorhergehenden Studien (Steril-Validierung) nachgewiesen wurde.
Ein Vorteil gegenüber dem Autoklavieren ist, dass keine Flüssigkeit im Assembly zurückbleibt und die Komponenten in der Regel kostengünstiger sind.
Beim Autoklavieren wird die Sterilität durch starke Hitze erreicht. Dabei werden die Assemblies unter Druck mit Heißwasserdampf (ca. 120 °C) behandelt. Dies kann entweder im eingebauten Zustand oder innerhalb der Verpackung, z. B. in gasdurchlässigen Tyvek-Beuteln, erfolgen. Da die Einwirkzeit und die Temperatur des Dampfes im Rahmen der Validierung festgelegt werden, liegt der Nachweis der Sterilität in der Verantwortung des Validierenden. Ein Vorteil gegenüber der Gammabestrahlung ist, dass angeschlossene Edelstahlelemente und andere Multi-Use-Komponenten gemeinsam mit den Single-Use-Assemblies sterilisiert werden können.